การพัฒนาวิธีการตรวจเนื้อสุกรปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์อาหารโดยวิธี loop-mediated isothermal amplification

Abstract

ได้ทำการพัฒนาการตรวจวิเคราะห์การปนเปื้อนเนื้อสุกรในผลิตภัณฑ์อาหารด้วยวิธี Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) และวิธี LAMP-Dot Blotting โดยการออกแบบไพรเมอร์ 4 เส้นคือ Forward Inner Primer (FIP), Backward Inner Primer (BIP), Outer Primer F3 และ Outer Primer B3 ที่จำเพาะยีน cytochrome b และเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสุกรด้วยวิธี LAMP พบว่าสภาวะที่เหมาะสมสำหรับปฏิกิริยาคือที่ 60 องศาเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง การทดสอบความจำเพาะของ LAMP และ LAMP-Dot Blotting ไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกลุ่มกับ เนื้อไก่ เนื้อวัว เนื้อเป็ด เนื้อแพะ เนื้อแกะ เนื้อปลาซาลมอน เนื้อกุ้ง เนื้อหอยแครง เนื้อหอยลาย เนื้อหอยนางรม เนื้อปลาหมึก เนื้อปู เนื้อนกกระจอกเทศ เนื้อสุนัข และเนื้อกบ มีความไวที่ขีดจำกัดต่ำสุดของดีเอ็นเอสุกร 1 นาโนกรัม ซึ่งเท่ากับวิธี PCR แต่น้อยกว่าวิธี Real-Time PCR 10 เท่า สำหรับเนื้อสุกรผสมเนื้อไก่และเนื้อสุกรผสมเนื้อวัวนั้นมีขีดจำกัดต่ำสุดที่ 10 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งน้อยกว่าวิธี PCR และ Real-Time PCR 100 เท่า และ 1000 เท่า ตามลำดับ ยกเว้น เนื้อสุกรผสมเนื้อวัวที่ทดสอบด้วย LAMP-Dot Blotting จะมีความไวกว่าวิธี LAMP 5 เท่า นอกจากนี้ยังพบว่าวิธี LAMP นั้นสามารถตรวจวิเคราะห์เนื้อสุกรที่ผ่านความร้อนที่ 0-120 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาทีได้ การวิเคราะห์การปนเปื้อนเนื้อสุกรด้วยเทคนิค LAMP กับผลิตภัณฑ์จากเนื้อสัตว์จำนวน 100 ตัวอย่างและตรวจสอบผลผลิตด้วยวิธีแยกขนาดด้วยกระแสไฟฟ้าบนวุ้นอะกาโรส ไซเบอร์กรีนวันสังเกตผลด้วยตาเปล่าภายใต้แสงไฟธรรมดา และภายใต้แสงยูวี และเทคนิค Dot blot hybridization เปรียบเทียบกับวิธี Real-Time PCR ที่เป็น Gold Standard ในการศึกษาครั้งนี้ การปนเปื้อนจากเนื้อสุกร 27, 13, 17, 24 ตัวอย่างตามลำดับ และการเปรียบเทียบวิธีการตรวจสอบผลผลิต LAMP ทั้ง 4 วิธีพบว่าการตรวจสอบผลผลิตด้วยไซเบอร์กรีนภายใต้แสงยูวีเป็นวิธีที่ดีที่สุด เนื่องจากมีความรวดเร็ว ความจำเพาะ และความไวสูงกว่าวิธีอื่น ส่วนวิธี LAMP Dot-Blotting ที่พัฒนาขึ้นจากงานวิจัยครั้งนี้ เป็นอีกหนึ่งวิธีที่สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการตรวจเนื้อสุกรปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์อาหาร ในภาคสนาม และห้องปฏิบัติการทั่วไป เนื่องจากมีความสะดวก และไม่ต้องใช้อุปกรณ์เฉพาะ